Хроматографические методы анализа: достоинства и недостатки

Хроматографический анализ сегодня является наиболее широко применяемым методом исследования различных объектов. Это могут быть пробы, взятые в окружающей среде, на производстве, в лаборатории и так далее. Этот метод предложил еще в 1903 году русский ученый М. С. Цвет. Его исследования стали основой для развития всех видов хроматографии, существующих на сегодняшний день и применяемых для разделения не только окрашенных, но и неокрашенных соединений во всевозможных средах. Проведение хроматографического анализа возможно различными способами, с использованием в каждом конкретном случае своих приемов и методик расчетов. В его основе лежат различия в адсорбционных или каких-либо других свойствах соединений, что способствует их распределению между твердым сорбентом и проходящей через него жидкостью (или газом).

хроматографические колонки

Основные понятия

Хроматографическим методом анализа называют такой метод разделения и определения веществ, который основан на распределении нескольких компонентов образца между двумя фазами, одна из которых подвижна, а другая - неподвижна.

Неподвижной (стационарной) фазой обычно бывает твердое пористое вещество (как правило, его называют сорбентом) или пленка жидкости, которая нанесена на твердое вещество.

Подвижная фаза представляет собой жидкое или газообразное вещество, протекающее сквозь неподвижную фазу, порой под давлением. Все компоненты анализируемой смеси (называемые сорбатами) вместе с подвижной фазой движутся вдоль стационарной фазы. Как правило, ее помещают в стеклянную (металлическую) трубку - колонку.

Скорость движения компонентов по колонке зависит от степени взаимодействия их с поверхностью сорбента. Это приводит к тому, что одни компоненты останутся в верхней части колонки, распределенные в объеме сорбента, другие в нижней, а некоторые и вовсе не задержатся в ней и уйдут с подвижной фазой.

Классификация хроматографических методов анализа

Эти методы исследования веществ настолько разнообразны, что не существует единой их классификации. Обычно их разделяют по следующим признакам:

  • агрегатное состояние сорбента и подвижной фазы;
  • механизм связывания вещества и сорбента;
  • техника проведения анализа;
  • способ движения пробы через колонку;
  • цель проведения анализа.

По агрегатному состоянию фаз

По данному признаку хроматографические методы анализа делят на:

  • газовую хроматографию, если подвижной фазой является пар или газ;
  • жидкостную хроматографию, когда подвижная фаза находится в жидком состоянии.

Первую, как правило, используют для разделения летучих термически устойчивых соединений с молекулярной массой до 300. Вторая годится для разделения органических и неорганических компонентов, имеющих молекулярную массу до 2000, даже если они термически неустойчивы.

разделение хлорофиллов а и с

По характеру взаимодействия вещества с неподвижной фазой

По механизму действия сорбента с веществом хроматографические методы анализа могут быть:

  • адсорбционными, если разделение основывается на различиях в сродстве компонентов образца к поверхности адсорбента;
  • распределительными, если разделение веществ основано на различиях их растворимости в подвижной фазе и сорбенте;
  • ионообменными, если разделение основывается на различиях в способностях компонентов к осуществлению ионного обмена;
  • проникающая, если разделение веществ происходит вследствие различий размеров и форм молекул, а также зарядов.

Также хроматографические методы анализа классифицируют по данному методу на осадочные, окислительно-восстановительные, комплексообразовательные и другие.

По технике эксперимента

По способу оформления процесса хроматография бывает:

  • колоночная, при которой разделение ведется в колонках, наполненных сорбентом.
  • плоскостная, которая может осуществляться на бумаге или на пластинах (тонкослойная хроматография).
бумажная хроматография

Также к этому перечню можно добавить методы хроматографического анализа, проводимые с помощью капилляров. Внутренний диаметр таких трубок составляет не более 1 мм. В сравнении с другими разновидностями хроматографии, эта позволяет повысить скорость проведения анализа и делает возможными исследования с дорогостоящими газами или сорбентами. Также малые размеры колонки позволяют сочетать такое исследование с масс-спектрометрией. Однако существенным недостатком хроматографического метода анализа такого вида является сложность ввода пробы в капилляр.

По движению вещества

Этот признак принято называть также способом хроматографирования. Различают:

  • Элюентную (проявительную) хроматографию. Лучше всего подходит для решения аналитических задач. Заключается он в том, что в смесь веществ, вводимая в непрерывно движущийся поток элюента, сорбируется лучше подвижной фазы. В ходе продвижения элюента по колонке с сорбированными компонентами они начинают перемещаться вдоль сорбента с разной скоростью и выходят из колонки отдельными фракциями (зонами). Достоинствами проявительного метода является более полное разделение веществ, непрерывная регенерация сорбента и хорошая воспроизводимость параметров удерживания.
  • Вытеснительную хроматографию. Состоит она в том, что в подвижную фазу вводят разделяемую пробу, а затем начинают пропускать вещество-вытеснитель, у которое сорбционная способность больше всех остальных. В ходе его продвижения по колонке, он вытесняет из сорбента ранее сорбированные вещества в порядке увеличения их сорбционной способности.
  • Фронтальную хроматографию. В ходе исследования анализируемая смесь также пропускается через слой сорбента. А в ходе заполнения колонки компонентами они постепенно выходят в порядке повышения их способности к сорбции.

По цели работы

Классификация хроматографических методов анализа в зависимости от цели проведения процесса выглядит следующим образом:

  • аналитическая хроматография - представляет собой самостоятельный метод, включающий разделение образца на компоненты, а также их качественный и количественный анализ;
  • препаративная хроматография - используется исключительно для разделения смеси веществ.

Достоинства метода

Хроматографический анализ имеет следующие преимущества перед прочими методами разделения и исследования веществ:

  1. Благодаря тому, что этот способ разделения имеет динамический характер, характеризующийся многократным повторением сорбции-десорбции, эффективность его значительно выше, чем у статических сорбции или экстракции.
  2. Использование различных типов взаимодействия сорбатов и сорбентов (физических и хемосорбционных), позволяет расширить круг веществ для селективного разделения.
  3. Некоторыми методиками предусмотрено наложение гравитационных, магнитных и других полей на выделяемые вещества, что расширяет возможности хроматографии путем изменения условий разделения компонентов.
  4. Этот метод является гибридным, поскольку сочетает разделение и определение сразу нескольких компонентов.
  5. Хроматография делает возможным решение нескольких задач одновременно. Так аналитические задачи включают разделение, идентификацию и определение веществ, а препаративные - их очистку, выделение и концентрирование.
проведение хроматографического анализа

Возможности хроматографии

Высокоэффективная и высокоселективная препаративная хроматография незаменима для разделения сложных образцов, содержащих большое число индивидуальных соединений с близкими физико-химическими параметрами (нефть, всевозможные лекарственные препараты, вытяжки из растений, биологические жидкости и другие). Так, для очистки химических веществ или же выделения отдельных соединений в препаративной химии широко применяются газовые методы хроматографического анализа. Для выделения ионов подходит ионообменная хроматография, основанная на различиях в способности ионов из раствора к обменным процессам с ионитом.

Современные хроматографические методы позволяют определять газообразные, жидкие и твердые вещества. Подбор условий проведения анализа ориентируется на природу и состав анализируемой пробы. Газоадсорбционная и газожидкостная хроматография позволяют исследовать летучие вещества, устойчивые к нагреванию. Так, газоадсорбционная хроматография широко используется для анализа газовых смесей и низкокипящих углеводородов, не имеющих активных функциональных групп. Газожидкостная хроматография важна в нефтехимии, анализе пестицидов и удобрений, лекарственных препаратов.

Жидкостный хроматографический анализ трансформаторного масла позволяет своевременно выявить дефекты или же характер и степень повреждения трансформатора. Его состояние оценивают путем сопоставления данных, полученных в ходе анализа с допустимыми значениями, а также по скорости изменения содержания газов в масле. Так, повышенное содержание СО и СО2 обычно сигнализирует о нарушениях в целлюлозной изоляции. А вот наличие фурановых производных говорит о старении бумажной изоляции. Таким образом, хроматографический анализ газов способствует безопасной и длительной работе оборудования.

Газовая хроматография

Является одной из самых распространенных разновидностей метода, из-за того, что для него разработаны различные методики с полным теоретическим обоснованием, а также имеется надежное и относительно недорогое аппаратурное оформление. Подвижной фазой (газом-носителем) являются газы или их смеси, а также вещества, являющиеся газами при тех условиях, в которых проводится анализ. Неподвижной фазой являются твердые сорбенты (газоадсорбционный метод) или жидкость на поверхности инертного носителя (газожидкостный метод).

газовая хроматография

Для газовой хроматографии можно дополнительно назвать ряд преимуществ:

  • высокую скорость процесса;
  • возможность анализа микропроб;
  • автоматическую запись результатов при наличии соответствующего оборудования;
  • возможность вычленения компонентов не только в лаборатории, но и в промышленных масштабах.

Бумажная хроматография

В качестве неподвижной фазы применяют фильтровальную или же специальную хроматографическую бумагу. Последняя представляет собой целлюлозная фильтровальная бумага особой чистоты и с некоторыми специальными свойствами. Она впитывает растворитель с разной скоростью капиллярного подъема, зависящей от плотности бумаги.

Основным оборудованием являются специальные камеры или сосуды, лотки, размещенные на стойках, пипетки, пульверизаторы, лампы для хроматограмм, измерительные приспособления, а еще планиметры и денситометры, используемые для количественных определений.

Этот метод лучше всего подходит для анализа всевозможных органических веществ, содержащих разные функциональные группы от спиртов до стероидов, от аминов до индолов, от витаминов до антибиотиков.

Ионообменная хроматография

Этот метод основан на обмене ионов между набухшим ионитом и подвижной фазой. Ионообменное разделение смеси ионов характеризуется различием их зарядов и ионной силой раствора. В объеме зерен ионита процесс разделения также зависит от скорости диффузии ионов, определяющейся плотностью ионита.

Ионит подбирают по параметру, называемому сродством, который пропорционален заряду иона и обратно пропорционально радиусу гидратированного иона. Выбор ионита ведут, пользуясь таблицами с приведенными характеристиками выпускаемых типов ионитов. Основные их характеристики — размер зерен и их форма, обменная емкость, кислотно-основные свойства, набухаемость, плотность.

ионный обмен в хроматографической колонке

Разделение неорганических веществ ведут на неорганических ионитах (цеолиты, гидроксиды алюминия) или смолах (стирол с дивинилбензолом). Так, часто применяется хроматографический метод анализа воды на наличие в ней различных ионов, например, для определения ее жесткости.

Гель-хроматография

Суть метода сводится к тому, что анализируемый раствор медленно фильтруется через колонки, наполненные гелем. Порой его называют гелъ-фильтрацией. Отдельные частицы геля состоят из пластичных линейных молекул веществ с высочайшей молекулярной массой, соединенных поперечными связями. Такая сетчатая структура способствует набуханию геля в воде и появлению в нем пор разного диаметра. Размеры пор зависят от природы полимера, температуры среды и природы растворителя.

Разделение основывается на способности более мелких молекул проникать глубже в поры и оставаться там на протяжении большего времени. Поэтому сначала из колонки выходят более крупные молекулы, а затем те, что помельче.

гель-хроматография

Этим методом проводят два вида разделения: групповое и фракционирование. Для первого характерно разделение смеси компонентов по их молекулярной массе. Для второго - по скорости и интенсивности диффузии частиц внутрь геля. Чаще всего применяется гель-хроматография в биохимии, в органических синтезах и химии полимеров для определения молекулярных масс. В качестве примера можно привести анализ хроматографическими методами белков и пептидов в плазме крови. В сравнении с масс-спектрометрическими методами отслеживание белково-пептидного гомеостаза по распределению белков и продуктов их распада гель-хроматографическим методом значительно более доступно.